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重要進展!m6A介導可翻譯circRNA的生成
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-02-12 | 658 次瀏覽 | 分享到:
以m6A為代表的RNA的轉錄后修飾是近期研究的熱點方向之一。2月11日,內華達大學里諾醫學院Wei YanChong Tang為共同通訊作者,在Cell Research雜志在線發表了一項circRNA m6A修飾的重要文章,報道發現小鼠雄性生殖細胞發育過程中m6A修飾可促進攜帶ORF的circRNA的生成([1])。

線性RNA的m6A修飾研究比較系統全面,已知在mRNA中,m6A修飾可以調控RNA的轉錄和可變剪切,高級結構,出核,穩定性和翻譯,存在組織和疾病特異性的修飾狀態變化。這些現象大部分在circRNA中有類似的發現,但關于m6A與circRNA的生成和高級結構的關系此前一直沒有相關的報道。本文的報道表明m6A修飾也可以調控circRNA的生成,增加了對m6A修飾在circRNA中功能的認識。


此前,已發表的circRNA的m6A修飾的功能主要包括:

*m6A可以啟動circRNA的翻譯推薦閱讀:重磅!m6A修飾促進環狀RNA翻譯

*circRNA的m6A修飾存在細胞和疾病特異性推薦閱讀:重大發現:circRNA存在細胞特異性的m6A修飾BioRxiv:HPH模型中circRNA的m6A修飾

*m6A介導circRNA的降解推薦閱讀:m6A介導mRNA和circRNA的降解

*m6A介導circRNA出核推薦閱讀:circRNA的m6A修飾再發一篇Nature Communications文章

本文報道發現在精子發生過程中減數分裂后的粗線期到圓形細胞的時期會生成大量circRNA,其中一些circRNA的反向拼接位點(junction point)兩側往往攜帶高水平的m6A修飾,而m6A經常會富集在mRNA的ORF起始密碼子和終止密碼子周圍。有趣的是,作者發現,近半數的這類circRNA攜帶較長的ORF,這些ORF的起始密碼子被m6A修飾,可結合核糖體。作者利用液質聯用證明了上百種這類circRNA跨接口ORF的翻譯產物。這一發現不僅證明了m6A可以介導circRNA的生成,還發現了一種全新的依賴circRNA實現線性RNA丟失后蛋白產物的穩定表達機制。


精子發生過程circRNA表達情況

早期研究發現,精子發生過程中,粗線期以后會出現RNA產物變短和包裝進入RNP顆粒的現象,RNA產物變短可能與可變剪切的增加或一些RNA降解機制有關,而RNP顆粒則可以保護一些特殊的mRNA避免被降解,以維持一些重要蛋白的表達。為系統研究精子發生過程中全轉錄組的變化情況,作者選擇粗線期,圓形細胞期和精子延長后的RNA進行全轉錄組分析和RNase R處理后的circRNA測序分析,結果表明隨著精子發生過程的進展,circRNA的豐度呈現增高趨勢,而這些circRNA所對應的線性mRNA卻是下降的。


圖1 精子發生過程中circRNA表達增高 ([1]


精子發生過程中circRNA生成與m6A修飾有關

作者發現隨著精子發生過程進展,Alkbh5基因表達下調,Alkbh5基因敲除小鼠中精子發生過程從粗線期,圓形細胞期到精子延長階段的circRNA表達會大幅增高。Anti-m6A RIP-seq測序分析表明,隨著精子發生的進展,circRNA拼接位點處的m6A修飾呈現增加趨勢。

圖2  精子發生過程circRNA的增加與m6A狀態有關 ([1]


精子發生過程中一部分外顯子circRNA帶有m6A起始密碼子的跨接口ORF

進一步分析這些circRNA分子,作者發現它們很多都是從mRNA的CDS區起始密碼子和終止密碼子周圍形成的,這些circRNA的拼接位點更多的傾向于恰好分布在CDS的其實和終止密碼子附近,并且這種攜帶了起始或終止密碼子的circRNA隨著精子發生的過程而呈現增加的趨勢。如果這些circRNA恰好包含了全長的CDS,就有可能存在這樣的機制:在精子發生的后期,細胞通過將RNA產物轉變成circRNA來彌補由于mRNA大量降解導致的蛋白翻譯模板不足,也就意味著在精子發生的后期,一些重要的蛋白是通過形成circRNA來維持其表達狀態的。Anti-m6A RIP-seq數據表明隨著精子發生過程進展,攜帶m6A的circRNA數目增加,并且這些circRNA更傾向于攜帶來源基因的起始或終止密碼子。核糖體測序和分離RNP后測序結果表明 ,隨著精子發生進展,Polysome結合的circRNA數目有所增加,結合著RNP顆粒中的circRNA也顯著增多。這是否預示著,circRNA也可以存在通過RNP結合并逐步釋放進行蛋白的表達?


圖3 一部分circRNA攜帶m6A修飾的跨接口ORF ([1]


精子發生過程中circRNA可包裝進入RNP并可釋放后結合核糖體

基于上述的發現,作者分析了精子發生的不同階段circRNA結合在RNP中和結合核糖體的情況,結果顯示隨著精子發生的進展,更多的circRNA會從RNP顆粒中釋放出來,結合核糖體,而它們所對應的線性RNA則逐漸被降解。ATAC-seq分析表明和粗線期相比,圓形細胞期的染色質松散性更低。


圖4  精子發生過程中circRNA可包裝進入RNP并可釋放后結合核糖體([1]


ALKBH5 和METTL3調控精子發生過程RNA m6A修飾

Alkbh5敲除小鼠中,粗線期,圓形細胞期和精子延伸期的細胞中circRNA的豐度一直很高,但野生型小鼠中circRNA的豐度是伴隨著精子發生過程逐步增高的。Alkbh5敲除小鼠中,相關circRNA的m6A水平顯著高于野生型。而Mettl3敲除的小鼠中則呈現相反的趨勢。


圖5 ALKBH5 和METTL3調控精子發生過程RNA m6A修飾([1]


精子攜帶大量保守性較高的circRNA 

作者發現精原細胞中circRNA的豐度甚至高于精母細胞和精子細胞。精原細胞中胞漿小滴(cytoplasmic droplets)也發現含有大量的circRNA分子。通路富集分析表明,胞漿小滴中攜帶的circRNA來源基因主要精子運動,精子能量代謝等,而在成熟精子中所攜帶的circRNA來源基因主要是組蛋白和DNA修飾相關的基因。有趣的是,作者還分析了精子頭部和整體精子中circRNA豐度的差異,結果表明精子的頭部僅攜帶了不到三分之一的總circRNA。作者還發現相對于年老的小鼠精子,年輕小鼠的精子中攜帶更多的circRNA。精子攜帶的circRNA中有30-50%在多種物種中高度保守。在人的精子標本中,高受孕率的精子攜帶更多的circRNA,也有相對于mRNA更高的豐度。


圖6 精子攜帶高保守性的circRNA ([1]


精原細胞中一些circRNA可被翻譯

上述的circRNA分子一方面攜帶了m6A修飾,另一方面也有證據可以結合核糖體,因此有理由推測這些circRNA分子可被翻譯,為進一步證明這一問題,作者通過circRNA的接口位點序列生成了虛擬肽段序列庫,并分析了蛋白質譜圖,找出了一些有質譜證據支持的跨接口翻譯產物。這種跨接口翻譯產物伴隨著精子成熟過程而升高,進一步說明精子成熟過程,circRNA的翻譯可能起到重要的作用。

圖7 精子成熟過程可翻譯circRNA的鑒定 ([1]


本文的報道填補了m6A修飾與circRNA生成相關性研究的空缺,推動了circRNA研究的進展。本文所描述的機制還可能對精子發生過程中基因表達的機制提供新的思路和認識,也暗示circRNA作為一種功能性的分子,在生命活動過程乃至一些病理發生發展過程中的重要意義。


參考文獻

1. Chong Tang, Y.X., Tian Yu, Na Liu, Zhuqing Wang , Rebekah J. Woolsey, Yunge Tang, Xinzong Zhang, Weibing Qin, Ying Zhang, Ge Song, Weiwei Zheng, Juan Wang, Weitian Chen, Xiongyi Wei, Zhe Xie, Rachel Klukovich, Huili Zheng, David R. Quilici and Wei Yan, m6A-dependent biogenesis of circular RNAs in male germ cells. Cell Research, 2020.

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